"Методические указания по определению остаточных количеств изофоса-3 в рисе, почве и воде газожидкостной и тонкослойной хроматографией"

Документ по состоянию на август 2014 г.


Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
А.И.ЗАИЧЕНКО
28 января 1980 г. N 2144-80


Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками при МСХ СССР.

Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Е.И. Марциновского и лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.


1. Краткая характеристика препарата

Изофос-3 - новый отечественный гербицид, рекомендуемый для борьбы с просовидными сорняками в посевах риса. Действующее начало препарата - O-(2-хлор,4-метилфенил)-N-(втор-бутиламидо)хлорметилтиофосфонат.

Структурная формула:


           ClCH   S
               \ // Cl
                P    ---
               / \ //   \\
    втор-CC H NH  O       CH                              C  H  ONPSCl
           4 9     \ ___ /  3                              12 18      2
                     ---                                  Мол. масса 326,0.

Синонимы отсутствуют.

В чистом виде - бесцветная вязкая жидкость с Т кип. 147 - 148 °С при 0,1 мм рт. ст. Хорошо растворим в ацетоне, гексане, бензоле, этилацетате. Растворимость в воде при 20 °С 1,87 мг/л. Р-значения в системе вода:органический растворитель для гексана 0,84, этилацетата 0,71, бензола 0,90.

    ЛД   для крыс 510 мг/кг.
      50

ДОК в рисе 0,1 мг/кг, ПДК в воде 0,4 мг/л. ПДК в почве не установлена.

2. Методика определения изофоса-3 в рисе, почве и воде газожидкостной и тонкослойной хроматографией

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод определения изофоса-3 в рисе основан на извлечении гербицида этилацетатом, из воды - гексаном, а из почвы - смесью гексана с ацетоном (4:1) или изопропилового спирта с бензолом (1:2) и определении газожидкостной хроматографией с термоионным детектором (ТИД) без очистки экстракта или тонкослойной хроматографией после очистки экстракта на колонке с окисью кремния для люминофоров.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Диапазон определяемых концентраций:


                                             ГЖХ                 ТСХ
                             рис      0,03 - 0,48 мг/кг   0,05 - 0,3 мг/кг
                             почва    0,01 - 0,16 мг/кг   0,05 - 0,3 мг/кг
                             вода     0,005 - 0,08 мг/л   0,001 - 0,006 мг

    Предел обнаружения 0,25 мг ГЖХ и 0,5 мкг ТСХ.
    Предел обнаружения:

                                             ГЖХ                 ТСХ
                             рис         0,03 мг/кг       0,05 мг/кг
                             почва       0,01 мг/кг       0,05 - 0,08 мг/кг
                             вода        0,005 мг/л       0,001 мг/л

    Среднее значение определения стандартных количеств изофоса-3 в % С при
п = 15:

                                             ГЖХ                ТСХ
                             рис             90,8               83,2
                             почва           85,9               81,0
                             вода            95,0               90,0

    Стандартное отклонение S в %:

                                             ГЖХ                ТСХ
                             рис           +/- 3,5            +/- 9,4
                             почва         +/- 7,9            +/- 8,8
                             вода          +/- 3,9            +/- 7,8

    Относительное стандартное отклонение S :
                                          2

                                             ГЖХ                ТСХ
                             рис           +/- 3,9            +/- 11,3
                             почва         +/- 9,1            +/- 10,9
                             вода          +/- 4,1            +/- 8,7

    Доверительный интервал среднего в % при р = 0,95 и п = 5:

                                             ГЖХ                ТСХ
                             рис        90,<...> +/- 4,5   83,2 +/- 12,1
                             почва      85,9 +/- 10,2      81,0 +/- 11,3
                             вода       95,0 +/- 5,0       90,0 +/- 10,0

    Размах варьирования в % R:

                                             ГЖХ                ТСХ
                             рис           73 - 98            70,0 - 90,5
                             почва         72 - 99            70 - 90
                             вода          82 - 100           80 - 100

2.1.3. Избирательность метода

Метод селективен. Прочие пестициды, применяемые на рисовых плантациях, в том числе рицид, рицид-П, ялан, пропанид, метафос, определению не мешают.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, ГОСТ 2603-71, хч, свежеперегнанный.

Гексан, ТУ-6-09-3375-78, хч, свежеперегнанный.

Бензол, ГОСТ 5955-75.

Изопропиловый спирт, СТ-ГОХП 15-235, хч.

Хлористый метилен, МРТУ 6-09-53-62-68, хч, свежеперегнанный.

Петролейный эфир (фр. 40 - 70 °С), ТУ-МХП 1867-48, ч, перегнанный.

Кремний окись (IV) для люминофоров, МРТУ-6-69-485-67.

    Окись  кремния  просеивают через сито с размером отверстий 0,2 мм (70 -
90  меш).  100  г  сорбента  помещают  в  фарфоровую  чашку  и активируют в
предварительно  нагретом  шкафу  до  130  °С  в  течение  7  часов. Сорбент
охлаждают  в  эксикаторе над P O , затем пересыпают в круглодонную колбу на
                              2 5
500  мл  с  притертой  пробкой  (колба  1). Колбу 1 хранят в эксикаторе без
осушающего  агента.  В  колбу  2  быстро  отвешивают  из  колбы  1  47,5  г
активированного  охлажденного  сорбента,  затем пипеткой очень аккуратно по
стенкам   колбы  вносят  2,5  мл  дистиллированной  воды.  Колбу  закрывают
притертой  пробкой  и ее содержимое тщательно встряхивают в течение 15 - 20
мин.  до  исчезновения комков. Колба 2 хранится в эксикаторе без осушающего
агента. Сорбент из колбы 2 годен к употреблению в течение 6 - 7 дней.

2,6-Дибромхинонхлоримид, МРТУ 6-09-5759-69, 0,5-процентный раствор в циклогексане.

Циклогексан, МРТУ 6-09-3112-66, хч.

Азотнокислое серебро, ГОСТ 1277-75.

Бромфеноловый синий.

Проявляющий бромфеноловый реагент. 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят до 100 мл 1-процентным раствором азотнокислого серебра в смеси ацетона с водой (3:1).

Уксусная кислота, ГОСТ 61-75, 5-процентный водный раствор.

Хроматон-N-супер (0,16 - 0,20 мм) с 3% SE-30.

Хроматон-N-AW-НМДS (0,125 - 0,160 мм).

Полидиэтиленгликольсукцинат (ПДЭГС), ТУ 6-11-15-68.

Пластинки "силуфол", ЧССР.

Хлористый натр, ГОСТ 4233-66, чда.

    Пятиокись фосфора P O , МРТУ 6-09-5759-69.
                       2 5

Сульфат натрия, ГОСТ 41-66-76, безводный и 1-процентный раствор.

Стандартные растворы изофоса-3 в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл (раствор А), 10 мкг/мл (раствор Б) и серия стандартных растворов с содержанием 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мкг/мл.

Раствор А готовят растворением 10 мг изофоса-3 в мерной колбе на 100 мл в ацетоне. Из раствора А пипеткой отбирают 10 мл и помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят колбу до метки ацетоном (раствор Б). Растворы А и Б стабильны при хранении в холодильнике в течение 1 года.

Для приготовления серии стандартных растворов из раствора Б в серию пробирок емкостью 10 мл с пришлифованными пробками пипеткой отбирают 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мл и соответственно добавляют пипеткой 9,9; 9,8; 9,5; 9,0; 8,0; 7,0 мл ацетона. Пробирки закрывают пробками. Серию стандартных растворов готовят ежедневно.

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74, газообразный из баллона.

Водород из баллона с редуктором или получаемый из генератора водорода.

Воздух из баллона или нагнетаемый компрессором.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Хроматограф Цвет-106 или аналогичный прибор с ТИД.

Хроматографическая камера с притертой крышкой.

Аппарат для встряхивания.

Кофейная мельница.

Ротационный вакуумный испаритель.

Почвенное сито.

Сито с размером отверстий 0,2 мм (70 - 90 меш).

Делительные воронки, ГОСТ 10054-75, на 1 л.

Хроматографическая колонка стеклянная длиной 20 см, внутренним диаметром 1 см с пористым фильтром в нижней части и с капельницей на шлифе.

Хроматографические колонки для ГЖХ стеклянные длиной 2 м и внутренним диаметром 3,5 мм, а такте длиной 1,5 м и внутренним диаметром 3 мм.

Колбы плоскодонные со шлифом, ГОСТ 10394-72, на 100, 500 и 1000 мл.

Мензурки, ГОСТ 1770-74, на 50, 100 и 500 мл.

Эксикатор.

Пипетки, ГОСТ 1770-74, на 1, 2, 10 и 25 мл.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, на 100 мл.

Пробирки с притертыми пробками на 10 мл.

Микрошприц на 10 мкл.

Пористый фильтр N 1.

2.4. Подготовка к определению

Подготовку хроматографа к работе проводят согласно инструкции.

Хроматографические камеры насыщают "подвижным растворителем" гексан:хлористый метилен (3:2) или петролейный эфир:ацетон (7:1) в течение 1 часа.

Перед анализом рис измельчают на кофейной мельнице до консистенции муки грубого помола. Для анализа берут 50 г.

Почву перед анализом просеивают через почвенное сито. Для анализа берут навеску почвы в естественно-влажном состоянии в количестве 20 г.

2.5. Проведение определения


Газохроматографическое определение

Рис. 50 г размолотого риса помещают в плоскодонную колбу на 1 л, добавляют 100 мл этилацетата и экстрагируют изофос-3 с помощью механического встряхивания в течение 30 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу прибора для отгонки растворителя. Экстракцию повторяют еще два раза тем же количеством растворителя. Отгоняют этилацетат с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 10 мл ацетона. Колбу закрывают притертой пробкой и тщательно обмывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл полученного раствора.

Вода. 500 мл воды помещают в делительную воронку емкостью 1 л, добавляют около 10 г хлористого натрия и экстрагируют изофос-3 тремя порциями по 100 мл этилацетата. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия и фильтруют через пористый фильтр N 1 в круглодонную колбу прибора для отгонки растворителя. Фильтр смывают небольшим количеством этилацетата. С помощью ротационного вакуумного растворителя полностью удаляют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона, колбу закрывают пробкой и тщательно смывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл полученного раствора.

Почва. Среднюю пробу почвы (20 г) помещают в плоскодонную колбу на 100 мл, заливают 50 мл смеси гексан:ацетон (4:1) или изопропиловый спирт:бензол (1:1) и экстрагируют изофос-3 в течение 30 мин. с помощью механического встряхивания. Переносят экстракт через бумажный фильтр в делительную воронку. Операцию повторяют еще два раза тем же количеством растворителя. К объединенному экстракту добавляют 30 мл 1-процентного раствора сульфата натрия, 50 мл ацетона и несколько раз осторожно, не взбалтывая, переворачивают воронку, предварительно закрыв ее пробкой. После разделения слоев водный нижний слой отбрасывают.

Верхний слой сливают в коническую колбу на 500 мл и сушат над безводным сульфатом натрия в течение 15 - 20 мин. при периодическом помешивании раствора. Высушенный экстракт фильтруют небольшими порциями в грушевидную колбу на 25 мл и отгоняют растворитель с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 - 2 мл. Последнюю порцию растворителя удаляют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл гексана. Колбу закрывают притертой пробкой, тщательно смывают стенки колбы растворителем. В хроматограф вводят 2 мкл полученного раствора.

Условия хроматографирования


Хроматограф Цвет-106 с ТИД
Наполнитель колонки                 3% SE-30 на         2% ПДЭГС на
                                    хроматоне-N-супер   хроматоне-N-AW-НМДS
Двина колонки                       200 см              150 см
Диаметр                             3,5 мм              3 мм
Скорость протяжки ленты самописца   0,33 см/мин.        0,33 см/мин.
                                           -10                -10
Рабочая шкала электрометра          10 х 10    А        2 х 10    А
Температура колонки                 210 °С              180 °С
            испарителя              220 °С              190 °С
Скорость азота                      60 мл/мин.          75 мл/мин.
         водорода                   18 мл/мин.          18 мл/мин.
         воздуха                    180 мл/мин.         180 мл/мин.
Время удерживания изофоса-3         3 мин. 35 с         9 мин. 25 с
                  ялана             23 с                30 с
                  рицида            1 мин. 6 с          3 мин. 42 с
                  рицида-П          1 мин. 16 с         2 мин. 27 с
                  метафоса          1 мин. 29 с         11 мин. 3 с
                  пропанида         1 мин. 50 с         19 мин. 2 с
                                                        (при 210°)
В хроматограф вводят                2 мкл               2 мкл
Линейность детектирования           0,25 - 4 нг         0,3 - 5 нг

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пиков.


Определение тонкослойной хроматографией

При определении методом ТСХ дополнительно проводят очистку экстракта на колонке с окисью кремния для люминофоров. Для очистки берут аликвоты из полученных по п. 2.6.1 конечных растворов.

Рис. Из 10 мл на очистку берут 2 мл, что эквивалентно 10 г риса.

Почва. К 2 мл добавляют еще 2 мл гексана и на очистку в зависимости от содержания гумуса (<= 4%) берут 1 или 2 мл полученного раствора, что эквивалентно 5 или 10 г почвы.

Вода. На очистку берут весь объем (2 мл) раствора.

    Отобранную  ацетоновую  аликвоту помещают в пробирку, полностью удаляют
растворитель.  К  сухому  остатку  пипеткой добавляют 2 мл гексана. Раствор
почвенной  пробы,  поскольку  она  растворена  в  гексане,  непосредственно
переносят  на  колонку. Полученные растворы также переносят на колонку. Для
подготовки  колонки отвешивают в химический стакан 5 г сорбента из колбы 2,
добавляют  к  нему  гексан,  содержимое  стаканчика  быстро  перемешивают и
переносят  на  колонку.  Предварительно на пористый фильтр колонки помещают
небольшой  ватный  тампон.  Колонку  заполняют  при  открытом  кране.  Кран
закрывают,  когда растворитель находится над слоем сорбента на расстоянии 3
мм.  Меняют приемник и при открытом кране колонки переносят рабочий раствор
(2  мл).  Дают  ему  полностью  впитаться  в сорбент. Колбу из-под рабочего
раствора  несколько  раз  ополаскивают 1 - 2 мл гексана, полученный раствор
также  переносят  на колонку. К колонке присоединяют капельницу, содержащую
20  мл  смеси  хлористого  метилена  с  гексаном (4:1) и по каплям начинают
добавлять  элюат.  По окончании элюирования отсоединяют приемник, добавляют
к  элюату чайную ложку безводного сульфата натрия и сушат раствор в течение
нескольких  мин.  Элюат  фильтруют  в  центрифужную  пробирку.  В  пробирку
помещают  заплавленный  в верхней части капилляр и отгоняют на водяной бане
растворитель,   добавляя   свежие   порции   фильтрата   по  мере  удаления
растворителя.  Остаток  (0,1  -  0,2 мл) при помощи того же капилляра, но с
отломанным     заплавленным     концом     количественно    переносят    на
хроматографическую  пластинку.  Одновременно  с рабочей пробой на пластинку
наносят  серию стандартных растворов изофоса-3 с содержанием 0,5; 1,0; 1,5;
2,0;  3,0  мкг.  Хроматограмму развивают в системе гексан:хлористый метилен
(3:2)   или   в  системе  петролейный  эфир:ацетон  (7:1).  После  развития
хроматограммы   ее   высушивают  и  обрабатывают  0,5-процентным  раствором
2,6-дибромхинонхлоримида   в   циклогексане  с  последующим  нагреванием  в
сушильном шкафу при температуре 40 °С в течение 5 мин. Изофос-3 проявляется
на  пластинах  в  виде  оранжевых  пятен на белом фоне с R  0,44 +/- 0,01 в
                                                          f
первой  системе  и  0,56  +/-  0,09  - во второй. Пятна стабильны в течение
длительного  времени.  Хроматограммы  можно  также  проявлять бромфеноловым
реагентом  с  последующим  снятием  фона  5-процентным  раствором  уксусной
кислоты.

2.6. Расчет результатов анализа


Газожидкостная хроматография

Содержание изофоса-3 в анализируемой пробе вычисляют по формуле:


                         Н   х С   х V
                          рп    ст
                     С = -------------, мг/кг или мг/л,
                         Н   х V  х А
                          ст    а

    где:
    Н   - высота пика анализируемой пробы в мм;
     рп
    Н   - высота пика стандарта в мм;
     ст
    С   - содержание изофоса-3 в стандарте в мг;
     ст
    V  -  объем  конечного  раствора,  из  которого  отбирают  аликвоту  на
хроматографирование в мл;
    V  - объем аликвоты, вводимой в хроматограф в мкл;
     а
    А - навеска анализируемого образца почвы в г или объем воды в мл.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит "зашкаливание", готовят менее концентрированные растворы, добавляя в конечный объем дополнительное замеренное количество растворителя.


Тонкослойная хроматография

Содержание изофоса-3 в анализируемой пробе вычисляют по формуле:


                              С
                               рп
                          С = ---, мг/кг или мг/л,
                               А

    где:
    С    -  количество  изофоса-3,  найденное в хроматографируемой пробе, в
     рп
мкг;
    А  - навеска анализируемого образца риса или почвы в г или объем воды в
мл.

3. Требования безопасности

При работе соблюдать требования безопасности, принятые для фосфорорганических соединений, легковоспламеняющихся жидкостей и при работе с водородом.

4. Литература

1. Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новикова, Т.В. Алдошина "Определение остаточных количеств новых отечественных гербицидов изофоса-2, изофоса-3 в рисе и воде методом газожидкостной хроматографии с термоионным детектором" в сб. "Газовая хроматография пестицидов", Таллин, 1972 г, 178 - 185.

2. Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новикова, Т.В. Алдошина "Определение изофоса-2, изофоса-3, рипида и ялана в рисе и воде ГЖХ" в книге "Методы определения микроколичеств пестицидов", М., "Колос", 1977, 219 - 222.

5. Авторы

Методические указания разработаны авторским коллективом ВНИИ химических средств защиты растений, г. Москва, К.Ф. Новиковой, Ф.Р. Мельцер, Т.В. Алдошиной, И.Л. Меерзон.

6. В настоящие Методические указания включена методика определения остаточных количеств изофоса-3 в почве методом ГЖХ и ТСХ, разработанная тем же коллективом авторов и утвержденная 18 ноября 1977 г. N 1798. Методика опубликована в "Методических указаниях по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде", ч. IX, 1979 г., стр. 120 - 124.